嗜肺军团菌来源的YafK家族蛋白呈现丝氨酸依赖的β-内酰胺水解活性

《Journal of Biological Chemistry》：A YafK family protein from Legionella pneumophila exhibits serine-dependent β-lactam hydrolysis activity

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时间：2026年06月25日

来源：Journal of Biological Chemistry 4.1

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YkuD超家族中的YafK亚家族成员已被重新定义为人半胱氨酸（Cys）依赖的酰胺 hydrolases（酰胺水解酶），参与细胞被膜重塑。然而，该保守支架是否支持额外的催化化学性质仍不清楚。本研究报道了嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）L

YkuD超家族中的YafK亚家族成员已被重新定义为人半胱氨酸（Cys）依赖的酰胺 hydrolases（酰胺水解酶），参与细胞被膜重塑。然而，该保守支架是否支持额外的催化化学性质仍不清楚。本研究报道了嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）Lpg1514的结构与功能鉴定。晶体结构显示，Lpg1514采用典型的YafK样折叠，并具有明确的底物结合口袋。生化分析揭示，Lpg1514介导β-lactam（β-内酰胺）周转。出乎意料的是，该活性依赖于一个保守的丝氨酸残基（Ser132），而经典的半胱氨酸（Cys174）在测试条件下对催化并非必需。突变和动力学分析支持一种非经典的丝氨酸依赖机制，这与YafK型酰胺酶和半胱氨酸依赖的L,D-转肽酶（L,D-transpeptidase, LDT）均不相同。在功能上，Lpg1514以Ser132依赖的方式促进嗜肺军团菌对β-内酰胺的耐受性，这与有限的催化效率及其在瞬时抗生素相互作用而非有效水解中的作用相一致。综上所述，这些发现拓展了YafK支架的功能库，并证明该折叠可以容纳机制不同的化学反应。在半胱氨酸中心谱系中出现丝氨酸依赖的β-内酰胺反应性，凸显了YkuD/YafK家族的催化可塑性，并提示了抗生素相互作用功能多样化的潜在途径。β-内酰胺抗生素通过靶向青霉素结合蛋白（Penicillin-Binding Protein, PBP）抑制细菌细胞壁合成，从而阻断4→3肽聚糖交联的形成。细菌已进化出多种策略来耐受或抵抗β-内酰胺，包括产生β-内酰胺酶（β-lactamase）和利用替代性细胞壁修饰酶。其中，YkuD超家族成员（又称L,D-转肽酶，LDT）催化肽聚糖的3–3交联，并通过催化性半胱氨酸残基与β-内酰胺抗生素相互作用。YafK蛋白作为YkuD超家族中的一个亚群，近期被重新定义为半胱氨酸依赖的酰胺水解酶，负责从肽聚糖上解离Braun氏脂蛋白（Braun's lipoprotein）。这一功能重定义确立了该支架中活性位点半胱氨酸的保守催化作用。然而，YafK蛋白是否严格局限于这种半胱氨酸依赖的化学性质，或能否支持替代性催化活性，仍是未知之数。嗜肺军团菌annotated为YafK家族成员的蛋白Lpg1514，其生化性质和生理作用尚未得到充分表征。本研究发表于《Journal of Biological Chemistry》，研究人员系统开展了Lpg1514的结构与酶学表征，揭示了该蛋白在β-内酰胺相互作用中的独特机制及其生理意义。研究人员为开展此项研究所采用的主要关键技术方法包括：X射线晶体学（用于解析Lpg1514ΔN29及其C174A突变体的高分辨率结构）；基于结构引导的序列比对与分子对接分析；定点诱变（site-directed mutagenesis）构建功能突变体；稳态动力学分析结合分光光度法检测酶活性；使用硝头孢菌素（nitrocefin）及碳青霉烯类抗生素（faropenem、biapenem）进行底物特异性与抑制动力学研究；以及基于嗜肺军团菌野生型、缺失突变株及互补菌株的抗生素敏感性表型分析。**Lpg1514的整体结构**研究人员解析了N端截短去除预测脂蛋白信号肽的Lpg1514ΔN29及其半胱氨酸突变体Lpg1514ΔN29C174A的晶体结构，分辨率分别为1.5 ?和2.1 ?。两种结构几乎一致，无可辨别的构象差异。Lpg1514采用由两个混合β-折叠片（β4–β9–β1–β2–β3和β5–β8）及两侧四个α-螺旋组成的紧凑折叠。一个显著的表面暴露沟槽由β5–β8折叠片、连接环区以及β3与β4之间的连接环构成，该沟槽定义了一个推定的底物结合口袋，估计体积约330 ?3。结构引导的序列比对表明，排列该口袋的残基在YafK亚家族蛋白中相对保守。通过DALI进行结构相似性搜索，鉴定出大肠杆菌DpaA（PDB: 8IKR）为最近缘同源物。DpaA中必需的Cys143和Lys83在Lpg1514中分别保守为Cys174和Lys110。分子对接分析显示，代表DpaA家族酰胺酶识别的Braun氏脂蛋白-肽聚糖连接底物关键组分的γ-D-Glu-mDAP和L-Lys均能以催化可合理构象容纳于保守底物结合口袋中，且保守半胱氨酸残基适当定位以利于亲核攻击。这些结构特征表明Lpg1514共享YafK蛋白的保守架构，并可能拥有类似的酰胺键水解催化框架。**Lpg1514促进嗜肺军团菌的β-内酰胺耐受性**为评估Lpg1514的生理作用，研究人员比较了野生型与Δlpg1514菌株的生长情况。在标准培养条件下，lpg1514的缺失对细菌生长无可检测影响；但在包括faropenem（0.5 μg/mL）和biapenem（1 μg/mL）的β-内酰胺胁迫下，Δlpg1514菌株较野生型表现出生长降低，而这一表型在野生型lpg1514互补后得以恢复，证明Lpg1514促进嗜肺军团菌的β-内酰胺耐受性。**Lpg1514展现β-内酰胺水解活性**研究人员使用呈色头孢菌素硝头孢菌素评估Lpg1514的酶活性。Lpg1514催化硝头孢菌素水解，表现为486 nm处吸光度增加。生化表征显示，Lpg1514在40 °C和pH 7.0时活性最大。稳态动力学分析表明，硝头孢菌素水解遵循Michaelis-Menten行为，Vmax为6.07 μM min-1，Km为69.83 μM，计算所得催化效率（kcat/Km）为8.69 × 103 M-1 min-1，表明其催化活性适中。对碳青霉烯类抗生素faropenem和biapenem的检测显示，经50 μM底物与递增浓度Lpg1514孵育24小时后，可检测到酶依赖的水解，提示缓慢周转。与此一致的是，预孵育Lpg1514与任一抗生素均显著降低后续硝头孢菌素水解，表明这些底物与酶形成相对稳定的复合物。灭活动力学分析显示，表观二级速率常数（kinact/Kapp）对biapenem为0.36 μM-1 min-1，对faropenem为0.64 μM-1 min-1，与慢处理及 prolonged 酶-底物驻留时间一致。**Ser132为β-内酰胺水解所必需，而Cys174则可替代**硝头孢菌素的分子对接模型提示，β-内酰胺环定位于底物结合口袋中Ser132与His166附近。定点诱变实验表明，在其他YafK蛋白（如DpaA）中对酰胺酶活性必需的保守半胱氨酸（C174A）替换后，硝头孢菌素水解未受显著影响，对碳青霉烯底物的结合亲和力仅适度降低。相反，Ser132的替换（S132A）则消除了可检测活性，表明该残基为β-内酰胺水解所必需。His166突变导致活性大幅降低，PROPKA计算其pKa为5.26，低于典型组氨酸残基，提示其在生理条件下主要去质子化，可能促进质子转移，潜在地在催化过程中活化Ser132。互补实验显示，在β-内酰胺胁迫下，野生型Lpg1514或C174A突变体的表达可恢复细菌生长，而S132A变异体则不能，建立了Ser132依赖的酶活性与嗜肺军团菌体内β-内酰胺耐受性之间的直接联系。在讨论部分，研究人员对YkuD超家族成员，特别是L,D-转肽酶的催化机制进行了比较分析。L,D-转肽酶通常利用催化性半胱氨酸介导肽聚糖交联并通过共价酰化与β-内酰胺抗生素相互作用，而YafK亚家族蛋白已被功能性地重新定义为L,D-内消旋二氨基庚二酸蛋白酰胺水解酶，其中保守半胱氨酸对切割Braun氏脂蛋白-肽聚糖连接至关重要。Lpg1514保留了YafK蛋白典型的保守结构特征和活性位点架构，包括与酰胺酶活性相关的催化半胱氨酸（Cys174）。尽管本研究未直接评估酰胺酶活性，但对接分析支持Lpg1514保留与已表征YafK酰胺酶底物识别模式相容的结构特征。然而，数据显示Cys174对β-内酰胺水解并非必需，表明该活性在机制上与为YafK酰胺酶和YkuD酶所描述的半胱氨酸依赖反应是可分离的。本研究的核心发现是鉴定Ser132为β-内酰胺水解的关键残基。虽然Ser132不属于经典YafK特征基序，但其在YafK同源物中保守。结构分析和对接研究将Ser132定位于β-内酰胺环附近，且该残基突变消除酶活性，凸显其功能重要性。His166同样贡献于活性，其计算pKa提示可能促进质子转移以活化Ser132。与经典丝氨酸β-内酰胺酶中嵌入保守序列基序并由广泛催化网络支持的催化丝氨酸不同，Lpg1514中的Ser132位于典型YafK活性位点之外，这一独特结构背景暗示Lpg1514采用一种可能不涉及完全优化催化三联体的独特催化策略。Lpg1514对β-内酰胺底物表现出相对较低的催化效率，仅在延长孵育后才发生水解。预孵育实验显示碳青霉烯类与酶形成稳定复合物，表明该活性可能代表一种潜伏或混杂的催化能力，反映YafK支架的进化可塑性，使其能够适应抗生素暴露等环境挑战。此行为类似于结核分枝杆菌L,D-转肽酶与β-内酰胺抗生素形成长寿命复合物的相互作用，但后者由催化半胱氨酸介导，而Lpg1514中保守半胱氨酸不参与β-内酰胺水解。值得注意的是，代表性青霉素类和头孢菌素类在竞争实验中既未影响Lpg1514活性，也未产生可检测的Lpg1514依赖表型，提示Lpg1514不太可能作为广谱β-内酰胺酶发挥功能，而是对碳青霉烯类化合物表现出一定程度的底 appoint 偏好。在几种代表性YafK亚家族成员中的检测显示，所有测试同源物均表现出可检测的硝头孢菌素水解活性，且大肠杆菌DpaA的突变分析揭示了与Lpg1514类似的残基需求，提示本研究发现的丝氨酸依赖β-内酰胺相互作用机制可能在YafK家族中保守，而非Lpg1514独有的特性。细菌生长实验证实Lpg1514以Ser132依赖的方式促进嗜肺军团菌的β-内酰胺耐受性，但效应幅度适中，提示Lpg1514可能是促进抗生素耐受的多个因素之一。相对较低的催化效率和缓慢周转暗示其主要作用可能并非直接的抗生素降解，而是与β-内酰胺的瞬时相互作用，贡献于耐受而非抗性。**研究结论**研究结论部分明确指出：本研究结果表明，YafK家族蛋白Lpg1514表现出依赖于保守丝氨酸残基的β-内酰胺水解活性，且该活性独立于经典半胱氨酸发挥作用。该活性可能代表嵌入YafK支架中的一种潜伏或混杂催化功能，反映允许蛋白适应抗生素压力的进化灵活性。

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